| Abstract |
Die bovine spongiforme Enzephalopathie, auch Rinderwahnsinn genannt, wurde erstmals 1986 in Großbritannien beobachtet und breitete sich in den folgenden Jahren in Europa aus. Ein Hauptübertragungsweg dieser Krankheit war vermutlich die Verfütterung von erregerhaltigen tierischen Futtermitteln von Wiederkäuern an die pflanzenfressenden Rinder. Experimentell konnte bestätigt werden, dass diese Krankheit auch auf andere Spezies, insbesondere auch den Menschen, übertragbar ist. Die Wissenschaft geht heute davon aus, dass der Mensch durch den Verzehr von BSE-erregerhaltigen Lebensmitteln mit BSE infizierbar ist und die neue Variante der Creutzfeld-Jakob-Krankheit auslösen kann. Um sowohl den Verbraucher, als auch die landwirtschaftlichen Nutztiere vor einer BSE Infektion zu schützen, wurde 2001 europarechtlich ein Verbot zur Verfütterung von Tiermehl erlassen. Aufgrund der rückläufigen BSE-Fallzahlen (2001: 125 infizierte Tiere; 2009: 2 BSE-Fälle [BMELV]) wurde in den letzten Jahren das Verbot gelockert, sodass einige Tiermehle (z.B. Fischmehl oder Blutmehl von Nicht-Wiederkäuern) wieder an diverse Spezies verfüttert werden dürfen. In Anbetracht dessen ist eine Methode zur Unterscheidung von Tiermehlen verschiedener Spezies von immenser Bedeutung, einerseits zur Einhaltung der lebensmittelrechtlichen Rahmenbedingungen, andererseits um eine Infektion und mögliche zukünftige Verbreitung von BSE zu verhindern. Neben der europarechtlich festgelegten mikroskopischen Analysemethode zur Untersuchung von Futtermitteln [Verordnung (EG) 152/2009], wurden weitere Methoden u.a. mit der Polymerasekettenreaktion oder Immunoassay zur Tiermehlunterscheidung entwickelt. Allerdings ist keine dieser Methoden sensitiv und selektiv genug, um zwischen allen Spezies unterscheiden zu können. Ziel dieser Diplomarbeit war es eine Methode zur Tierartidentifizierung in Tiermehl mittels Elektrosprayionisation und hochauslösender Hybrid-Massenspektrometrie (ESIqTOF-MS) zu etablieren. Anhand des Markerproteins Osteocalcin sollte aufgrund dessen variabler Aminosäuresequenz eine speziesspezifische Identifizierung möglich sein. Unter Berücksichtigung der EG-Verordnung 999/2001, in der festgelegt ist, dass die Tiermehle während der Verarbeitung auf mindestens 133 °C (3 bar, 20 Minuten) erhitzt werden, wurden Tiermehlproben mit einer unterschiedlichen Sterilisationstemperatur (133 °C bis141 °C) der Spezies Rind, Schwein und Huhn untersucht. Die Probenaufarbeitung (Festphasenextraktion mit ZipTip-C18-Pipettenspitzen und zweidimensionale Hochdruckflüssigchromatographie), sowie die Analyse mit einem MALDI-TOF-MS als Screening-Methode wurden gemäß dem Protokoll von Balizs et al. [2010] durchgeführt. Da die alleinige Aufreinigung der Tiermehlproben mit der Festphasenextraktion nicht ausreichend war, wurde für die Analyse mit dem ESI-qTOFMSdie zweidimensionale HPLC als Probenaufarbeitung verwendet. Für die Identifizierung des Osteocalcins in den trypsinierten Probenlösungen war eine Kopplung einer nano-HPLC an ein hochauflösendes Hybrid-Massenspektrometer besonders geeignet. Die Trennung der Peptide des Osteocalcins erfolgte mit einer Reversed-Phase-Chromatographie basierend auf Gradientenelution und der vorherigen Anreicherung mit einer Vorsäule. Die eluierten Peptide wurden im Anschluss massenspektrometrisch analysiert und identifiziert. Mit Hilfe dieser Methode konnte eine Identifizierung des Osteocalcins bis zu einer Prozessierungstemperatur <141 °C anhand des spezifischen Peptids 1-19 (dreifachgeladen), und den unspezifischen Peptiden AS 20-43 und AS 21-44 (drei- und vierfachgeladen) des trypsinierten Osteocalcins in bovinen und porcinen Tiermehl gewährleisten werden. Das trypsinierte Osteocalcin in der avianen Tiermehlprobe konnte anhand der Peptide AS 45-49, AS 1-20 (dreifachgeladen), AS 21-44 (drei- und vierfachgeladen), AS 21-43 (dreifachgeladen) nachgewiesen werden. In den hoch erhitzten Tiermehlen war es trotz diverser Optimierungsansätze wie eine zusätzliche 30 kDa Ultrazentrifugation während der Probenaufarbeitung und eine Filtrierung der Probenlösung nicht möglich Osteocalcin zu detektieren. Dies könnte mit der Degradation des Osteocalcins und hohen Kollagengehalt der Tiermehlproben begründet werden. Weiterhin könnte das Alter der Tiere, welche für die Tiermehlherstellung verwendet wurden, eine Rolle spielen. Jungtiere weisen nur geringe Osteocalcinkonzentrationen in den Knochen auf, was eine Detektion des Osteocalcins ind em möglicherweise daraus hergestellten Tiermehl erschwerte. Zukünftig können auch Tiermehle anderer Spezies mit unterschiedlichen Prozessierungstemperaturen verschiedener Hersteller mit dieser Methode analysiert werden. Weiterhin besteht die Möglichkeit den Osteocalcin-Gehalt in dem Tiermehl zu quantifizieren.
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